Trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET)
Il trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) è un processo di trasferimento di energia non radiativo in cui l'energia dello stato eccitato del donatore viene trasferita allo stato eccitato dell'accettore attraverso l'interazione di coppie elettriche intermolecolari.Questo processo non coinvolge fotoni ed è quindi non radiativo.Questo test ha il vantaggio di essere veloce, sensibile e semplice.
Il colorante utilizzato nel test FRET può essere identico.Ma nella maggior parte delle applicazioni vengono effettivamente utilizzati coloranti diversi.In breve, il trasferimento dell'energia di risonanza luminosa è il trasferimento di una coppia di dipoli dal donatore (colorante 1) all'accettore (colorante 2) quando il gruppo donatore è eccitato.In generale, lo spettro di emissione del gruppo fluoroforo donatore si sovrappone allo spettro di assorbimento del gruppo accettore.“Quando la distanza tra i due fluorofori è appropriata (10 – 100 A), si può osservare il trasferimento dell’energia del fluoroforo dal donatore all’accettore.”Il metodo di trasferimento dell'energia dipende dalla struttura chimica del recettore:
1. Viene convertito in vibrazione molecolare, cioè la luce luminosa del trasferimento di energia scompare.(Il recettore è un leggero quencher)
2. L’emissione è più intensa del recettore stesso, determinando uno spostamento verso il rosso nello spettro di fluorescenza secondaria.”(I recettori sono emettitori luminosi).
Il gruppo donatore (EDANS) e il gene accettore (DABCYL) sono uniformemente legati al substrato naturale della proteasi dell'HIV e, quando il substrato non è disconnesso, DABCYL può quenire l'EDANS e quindi diventare non rilevabile dal fluoro.Dopo la disconnessione della proteasi dell'HIV-1, EDANS non viene più spento da DABCYL e le luciferasi EDANS possono successivamente essere rilevate.La disponibilità degli inibitori della proteasi può essere monitorata dai cambiamenti nell'intensità della fluorescenza dell'EDANS.
I peptidi FRET sono strumenti utili per studiare la nonspecificità della peptidasi.Poiché il suo processo di reazione può essere monitorato continuamente, fornisce un metodo conveniente per rilevare l'attività enzimatica.La lucentezza prodotta dopo l'idrolisi dei legami peptidici da parte del donatore/accettore fornisce una misura dell'attività enzimatica a concentrazioni nanomolari.Quando il peptide FRET è intatto, mostra un'improvvisa scomparsa del flash interno, ma quando qualsiasi legame peptidico opposto al donatore/accettore si rompe, rilascia un flash, che può essere rilevato continuamente e l'attività dell'enzima può quindi essere quantificata.
Orario di pubblicazione: 14 agosto 2023