Trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)
Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è un processo di trasferimento di energia non radiativo in cui l'energia dello stato eccitato del donatore viene trasferita allo stato eccitato dell'accettore attraverso l'interazione di coppie elettriche intermolecolari. Questo processo non coinvolge fotoni ed è quindi non radiativo. Questo test ha i vantaggi di essere veloci, sensibili e semplici.
Il colorante utilizzato nel test FRET può essere identico. Ma nella maggior parte delle applicazioni, vengono effettivamente utilizzati coloranti diversi. In breve, il trasferimento di energia di risonanza luminosa è il trasferimento di una coppia di dipoli dal donatore (colorante 1) all'accettore (colorante 2) quando il gruppo donatore è eccitato. In generale, lo spettro di emissione del gruppo di fluoroforo donatore si sovrappone allo spettro di assorbimento del gruppo accettore. "Quando è appropriata la distanza tra i due fluorofori (10 - 100 A), si può osservare il trasferimento di energia del fluoroforo dal donatore all'accettore." Il metodo di trasferimento di energia dipende dalla struttura chimica del recettore:
1. Viene convertito in vibrazioni molecolari, cioè la luce luminosa del trasferimento di energia scompare. (Il recettore è un estencher leggero)
2. L'emissione è più intensa del recettore stesso, risultando in un spostamento verso il rosso nello spettro di fluorescenza secondaria. " (I recettori sono emettitori luminosi).
Il gruppo di donatori (Edans) e il gene accettore (dabcil) sono uniformemente collegati al substrato naturale della proteasi dell'HIV e quando il substrato non è scollegato, il dabcil può quenle Edan e quindi diventare non rilevabile al fluoro. Dopo la disconnessione della proteasi dell'HIV-1, Edans non viene più estinto da Dabcil e successivamente le luciferasi di Edans possono essere rilevate. La disponibilità di inibitori della proteasi può essere monitorata dai cambiamenti nell'intensità della fluorescenza degli Edan.
I peptidi FRET sono strumenti convenienti per studiare la non specificità della peptidasi. Poiché il suo processo di reazione può essere continuamente monitorato, fornisce un metodo conveniente per rilevare l'attività degli enzimi. La lucentezza prodotta dopo l'idrolisi dei legami peptidici da parte del donatore/accettore fornisce una misura dell'attività enzimatica a concentrazioni nanomolari. Quando il peptide FRET è intatto, mostra un'improvvisa scomparsa del flash interno, ma quando qualsiasi legame peptidico di fronte al donatore/accettore si rompe, rilascia un flash, che può essere rilevato continuamente e l'attività enzimatica può quindi essere quantificata.
Tempo post: 2025-07-02