I peptidi sono una classe di composti formati dalla connessione di più amminoacidi attraverso legami peptidici.Sono onnipresenti negli organismi viventi.Finora sono stati trovati decine di migliaia di peptidi negli organismi viventi.I peptidi svolgono un ruolo importante nella regolazione delle attività funzionali di vari sistemi, organi, tessuti e cellule e nelle attività della vita, e sono spesso utilizzati nell'analisi funzionale, nella ricerca sugli anticorpi, nello sviluppo di farmaci e in altri campi.Con lo sviluppo della biotecnologia e della tecnologia di sintesi peptidica, sono stati sviluppati e applicati in clinica sempre più farmaci peptidici.
Esiste un'ampia varietà di modifiche peptidiche, che possono essere semplicemente suddivise in post modifica e modifica del processo (utilizzando la modifica dell'amminoacido derivato) e modificazione N-terminale, modificazione C-terminale, modificazione della catena laterale, modificazione dell'amminoacido, modificazione dello scheletro, ecc., a seconda del sito di modifica (Figura 1).Essendo un mezzo importante per modificare la struttura della catena principale o i gruppi delle catene laterali delle catene peptidiche, la modifica dei peptidi può modificare efficacemente le proprietà fisiche e chimiche dei composti peptidici, aumentare la solubilità in acqua, prolungare il tempo di azione in vivo, modificare la loro distribuzione biologica, eliminare l'immunogenicità , ridurre gli effetti collaterali tossici, ecc. In questo articolo vengono introdotte diverse importanti strategie di modificazione dei peptidi e le loro caratteristiche.
1. Ciclizzazione
I peptidi ciclici hanno molte applicazioni in biomedicina e molti peptidi naturali con attività biologica sono peptidi ciclici.Poiché i peptidi ciclici tendono ad essere più rigidi dei peptidi lineari, sono estremamente resistenti al sistema digestivo, possono sopravvivere nel tratto digestivo e mostrano un’affinità più forte per i recettori bersaglio.La ciclizzazione è il modo più diretto per sintetizzare peptidi ciclici, soprattutto per peptidi con grande scheletro strutturale.In base alla modalità di ciclizzazione, può essere divisa in tipo catena laterale, tipo terminale - catena laterale, terminale - tipo terminale (tipo end-to-end).
(1) sidechain a sidechain
Il tipo più comune di ciclizzazione da catena laterale a catena laterale è il ponte disolfuro tra i residui di cisteina.Questa ciclizzazione viene introdotta dalla deprotezione di una coppia di residui di cisteina e quindi ossidati per formare legami disolfuro.La sintesi policiclica può essere ottenuta mediante rimozione selettiva dei gruppi protettivi sulfidrilici.La ciclizzazione può essere eseguita in un solvente post-dissociazione o su una resina pre-dissociativa.La ciclizzazione sulle resine può essere meno efficace della ciclizzazione con solvente perché i peptidi sulle resine non formano facilmente conformazioni ciclizzate.Un altro tipo di ciclizzazione catena laterale - catena laterale è la formazione di una struttura ammidica tra un residuo di acido aspartico o acido glutammico e l'amminoacido base, che richiede che il gruppo protettivo della catena laterale possa essere rimosso selettivamente dal polipeptide sulla resina o dopo la dissociazione.Il terzo tipo di ciclizzazione catena laterale - catena laterale è la formazione di eteri difenilici da parte della tirosina o della p-idrossifenilglicina.Questo tipo di ciclizzazione nei prodotti naturali si trova solo nei prodotti microbici e i prodotti di ciclizzazione spesso hanno un potenziale valore medicinale.La preparazione di questi composti richiede condizioni di reazione uniche, quindi non vengono spesso utilizzati nella sintesi di peptidi convenzionali.
(2) da terminale a sidechain
La ciclizzazione della catena lato terminale di solito coinvolge il terminale C con il gruppo amminico della catena laterale della lisina o dell'ornitina, o il terminale N con la catena laterale dell'acido aspartico o dell'acido glutammico.Altre ciclizzazioni polipeptidiche vengono effettuate formando legami eterei tra il terminale C e le catene laterali della serina o della treonina.
(3) Tipo terminale o testa-coda
I polipeptidi a catena possono essere ciclati in un solvente o fissati su una resina mediante ciclazione della catena laterale.Basse concentrazioni di peptidi dovrebbero essere utilizzate nella centralizzazione del solvente per evitare l'oligomerizzazione dei peptidi.La resa di un polipeptide ad anello sintetico testa-coda dipende dalla sequenza del polipeptide a catena.Pertanto, prima di preparare peptidi ciclici su larga scala, dovrebbe essere creata una libreria di possibili peptidi piombo concatenati, seguita dalla ciclizzazione per trovare la sequenza con i migliori risultati.
2. N-metilazione
La N-metilazione si verifica originariamente nei peptidi naturali e viene introdotta nella sintesi peptidica per prevenire la formazione di legami idrogeno, rendendo così i peptidi più resistenti alla biodegradazione e all'eliminazione.La sintesi di peptidi utilizzando derivati di amminoacidi N-metilati è il metodo più importante.Inoltre, è possibile utilizzare anche la reazione Mitsunobu degli intermedi della resina polipeptidica N-(2-nitrobenzene solfonil cloruro) con metanolo.Questo metodo è stato utilizzato per preparare librerie di peptidi ciclici contenenti amminoacidi N-metilati.
3. Fosforilazione
La fosforilazione è una delle modificazioni post-traduzionali più comuni in natura.Nelle cellule umane, più del 30% delle proteine sono fosforilate.La fosforilazione, in particolare la fosforilazione reversibile, svolge un ruolo importante nel controllo di molti processi cellulari, come la trasduzione del segnale, l'espressione genica, la regolazione del ciclo cellulare e del citoscheletro e l'apoptosi.
La fosforilazione può essere osservata in una varietà di residui aminoacidici, ma i bersagli della fosforilazione più comuni sono i residui di serina, treonina e tirosina.I derivati della fosfotirosina, della fosfotreonina e della fosfoserina possono essere introdotti nei peptidi durante la sintesi o formati dopo la sintesi del peptide.La fosforilazione selettiva può essere ottenuta utilizzando residui di serina, treonina e tirosina che rimuovono selettivamente i gruppi protettivi.Alcuni reagenti di fosforilazione possono anche introdurre gruppi di acido fosforico nel polipeptide mediante post-modificazione.Negli ultimi anni, la fosforilazione sito-specifica della lisina è stata ottenuta utilizzando una reazione Staudinger-fosfito chimicamente selettiva (Figura 3).
4. Miristoilazione e palmitoilazione
L'acilazione dell'N-terminale con gli acidi grassi consente ai peptidi o alle proteine di legarsi alle membrane cellulari.La sequenza miridamoilata sull'N-terminale consente alle proteine chinasi della famiglia Src e alle proteine Gaq della trascrittasi inversa di essere mirate a legarsi alle membrane cellulari.L'acido miristico è stato collegato all'N-terminale della resina-polipeptide utilizzando reazioni di accoppiamento standard e il lipopeptide risultante potrebbe essere dissociato in condizioni standard e purificato mediante RP-HPLC.
5. Glicosilazione
I glicopeptidi come la vancomicina e la teicolanina sono antibiotici importanti per il trattamento delle infezioni batteriche resistenti ai farmaci e altri glicopeptidi sono spesso utilizzati per stimolare il sistema immunitario.Inoltre, poiché molti antigeni microbici sono glicosilati, è di grande importanza studiare i glicopeptidi per migliorare l'effetto terapeutico dell'infezione.D'altra parte, è stato scoperto che le proteine sulla membrana cellulare delle cellule tumorali presentano una glicosilazione anomala, il che fa sì che i glicopeptidi svolgano un ruolo importante nella ricerca sul cancro e sulla difesa immunitaria tumorale.I glicopeptidi vengono preparati mediante il metodo Fmoc/t-Bu.I residui glicosilati, come la treonina e la serina, vengono spesso introdotti nei polipeptidi da fMOC attivati dall'estere pentafluorofenolo per proteggere gli amminoacidi glicosilati.
6. Isoprene
L'isopentadienilazione avviene sui residui di cisteina nella catena laterale vicino al C-terminale.L'isoprene proteico può migliorare l'affinità della membrana cellulare e formare un'interazione proteina-proteina.Le proteine isopentadienate comprendono la tirosina fosfatasi, la piccola GTasi, le molecole di cochaperone, la lamina nucleare e le proteine leganti centromeriche.I polipeptidi di isoprene possono essere preparati utilizzando isoprene su resine o introducendo derivati della cisteina.
7. Modifica del glicole polietilenico (PEG).
La modifica del PEG può essere utilizzata per migliorare la stabilità idrolitica delle proteine, la biodistribuzione e la solubilità dei peptidi.L'introduzione di catene PEG nei peptidi può migliorare le loro proprietà farmacologiche e anche inibire l'idrolisi dei peptidi da parte degli enzimi proteolitici.I peptidi PEG attraversano la sezione trasversale dei capillari glomerulari più facilmente dei normali peptidi, riducendo notevolmente la clearance renale.A causa dell’emivita attiva prolungata dei peptidi PEG in vivo, il livello di trattamento normale può essere mantenuto con dosi più basse e farmaci peptidici meno frequenti.Tuttavia, la modifica del PEG ha anche effetti negativi.Grandi quantità di PEG impediscono all'enzima di degradare il peptide e riducono anche il legame del peptide al recettore bersaglio.Ma la bassa affinità dei peptidi PEG è solitamente compensata dalla loro emivita farmacocinetica più lunga e, essendo presenti nel corpo più a lungo, i peptidi PEG hanno una maggiore probabilità di essere assorbiti nei tessuti bersaglio.Pertanto, le specifiche del polimero PEG dovrebbero essere ottimizzate per ottenere risultati ottimali.D’altro canto, i peptidi PEG si accumulano nel fegato a causa della ridotta clearance renale, determinando la sindrome macromolecolare.Pertanto, le modifiche del PEG devono essere progettate con maggiore attenzione quando i peptidi vengono utilizzati per i test antidroga.
I gruppi di modificazione comuni dei modificatori PEG possono essere riassunti approssimativamente come segue: Amino (-ammina) -NH2, aminometil-Ch2-NH2, idrossi-OH, carbossi-Cooh, sulfidrile (-tiolo) -SH, Maleimide -MAL, succinimide carbonato - SC, succinimide acetato -SCM, succinimide propionato -SPA, n-idrossisuccinimide -NHS, acrilato-ch2ch2cooh, aldeide -CHO (come propional-ald, butirALD), base acrilica (-acrilato-acrl), azido-azide, biotinile - Biotina, fluoresceina, glutaril -GA, acrilato idrazide, alchino-alchino, p-toluensolfonato -OT, succinimide succinato -SS, ecc. I derivati PEG con acidi carbossilici possono essere accoppiati ad ammine n-terminali o catene laterali di lisina.Il PEG amminoattivato può essere accoppiato alle catene laterali dell'acido aspartico o dell'acido glutammico.Il PEG mal attivato può essere coniugato al mercaptano delle catene laterali della cisteina completamente deprotette [11].I modificatori del PEG sono comunemente classificati come segue (nota: mPEG è metossi-PEG, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) modificatore PEG a catena lineare
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butirALD, mPEG-SS
(2) modificatore PEG bifunzionale
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
(3) modificatore PEG di ramificazione
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8. Biotinizzazione
La biotina può essere fortemente legata all'avidina o alla streptavidina e la forza legante è addirittura vicina al legame covalente.I peptidi marcati con biotina sono comunemente usati nei test immunologici, nell'istocitochimica e nella citometria a flusso basata sulla fluorescenza.Gli anticorpi antibiotina marcati possono essere utilizzati anche per legare i peptidi biotinilati.Le etichette della biotina sono spesso attaccate alla catena laterale della lisina o al terminale N.L'acido 6-aminocaproico viene spesso utilizzato come legame tra peptidi e biotina.Il legame è flessibile nel legarsi al substrato e lega meglio in presenza di impedimento sterico.
9. Etichettatura fluorescente
La marcatura fluorescente può essere utilizzata per tracciare i polipeptidi nelle cellule viventi e per studiare enzimi e meccanismi d'azione.Il triptofano (Trp) è fluorescente, quindi può essere utilizzato per l'etichettatura intrinseca.Lo spettro di emissione del triptofano dipende dall'ambiente periferico e diminuisce al diminuire della polarità del solvente, proprietà utile per rilevare la struttura peptidica e il legame ai recettori.La fluorescenza del triptofano può essere attenuata dall'acido aspartico protonato e dall'acido glutammico, che possono limitarne l'uso.Il gruppo Dansyl cloruro (Dansyl) è altamente fluorescente quando legato a un gruppo amminico e viene spesso utilizzato come etichetta fluorescente per amminoacidi o proteine.
La conversione energetica della risonanza di fluorescenza (FRET) è utile per gli studi sugli enzimi.Quando viene applicato FRET, il polipeptide substrato solitamente contiene un gruppo di marcatura della fluorescenza e un gruppo di spegnimento della fluorescenza.I gruppi fluorescenti marcati vengono spenti dal quencher attraverso il trasferimento di energia non fotonica.Quando il peptide si dissocia dall'enzima in questione, il gruppo marcante emette fluorescenza.
10. Polipeptidi in gabbia
I peptidi gabbia hanno gruppi protettivi otticamente rimovibili che impediscono al peptide di legarsi al recettore.Quando esposto ai raggi UV, il peptide viene attivato, ripristinando la sua affinità con il recettore.Poiché questa attivazione ottica può essere controllata in base al tempo, all'ampiezza o alla posizione, i peptidi gabbia possono essere utilizzati per studiare le reazioni che si verificano nelle cellule.I gruppi protettivi più comunemente usati per i polipeptidi a gabbia sono i gruppi 2-nitrobenzilici e i loro derivati, che possono essere introdotti nella sintesi peptidica tramite derivati amminoacidici protettivi.I derivati degli amminoacidi che sono stati sviluppati sono lisina, cisteina, serina e tirosina.I derivati dell'aspartato e del glutammato, tuttavia, non sono comunemente usati a causa della loro suscettibilità alla ciclizzazione durante la sintesi e la dissociazione del peptide.
11. Peptide poliantigenico (MAP)
I peptidi corti solitamente non sono immuni e devono essere accoppiati alle proteine trasportatrici per produrre anticorpi.Il peptide poliantigenico (MAP) è composto da più peptidi identici collegati ai nuclei di lisina, che possono esprimere specificamente immunogeni ad alta potenza e possono essere utilizzati per preparare coppie proteiche trasportatrici del peptide.I polipeptidi MAP possono essere sintetizzati mediante sintesi in fase solida su resina MAP.Tuttavia, l'accoppiamento incompleto risulta in catene peptidiche mancanti o troncate su alcuni rami e quindi non presenta le proprietà del polipeptide MAP originale.In alternativa, i peptidi possono essere preparati e purificati separatamente e quindi accoppiati al MAP.La sequenza peptidica attaccata al nucleo peptidico è ben definita e facilmente caratterizzata mediante spettrometria di massa.
Conclusione
La modifica del peptide è un mezzo importante per progettare i peptidi.I peptidi modificati chimicamente non solo possono mantenere un'elevata attività biologica, ma anche evitare efficacemente gli inconvenienti di immunogenicità e tossicità.Allo stesso tempo, la modificazione chimica può conferire ai peptidi alcune nuove eccellenti proprietà.Negli ultimi anni, il metodo di attivazione del CH per la post-modificazione dei polipeptidi è stato rapidamente sviluppato e sono stati raggiunti molti risultati importanti.
Orario di pubblicazione: 20 marzo 2023