Sfondo
Melanotan I, noto anche come Afamelanotide, è un polipeptide lineare composto da 13 aminoacidi destinato a svolgere un ruolo sempre più significativo nella ricerca farmaceutica. I nomi inglesi principali di Melanotan I sono Melanotan-1 e Afamelanotide. Come analogo sintetico dell'ormone stimolante gli α-melanociti α-MSH), Melanotan I può essere usato per trattare i disturbi di fotosensibilità causati dalla protoporfiria eritropoietica. Attualmente, la maggior parte dei prodotti Melanotan I sono etichettati solo per uso di ricerca e non sono ancora destinati all'applicazione umana. Nella sintesi tradizionale in fase solida, la scelta della resina ha un impatto significativo sull'efficienza di accoppiamento e sulla purezza finale del prodotto.
Informazioni di base
Nome cinese: Melanotan 1
Nome inglese: Melanotan-1
N. azienda: GT-A006
N. CAS: 75921-69-6
Sequenza: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
Formula molecolare: C78H111N21O19
Peso molecolare: 1646,88
Metodo di preparazione
IO. Preparazione della resina Fmoc-Val-ammino
Passaggio 1:Pesare 11,11 g (5 mmol) di resina Ramage Amide AM con un grado di sostituzione di 0,45 mmol/g e aggiungerli a un reattore in fase solida. Aggiungere DCM per gonfiare la resina per 30 minuti, quindi scolare. Lavare tre volte con DMF. Aggiungere una soluzione DMF contenente il 20% di piperidina (v/v) e reagire per 5 minuti. Aggiungere un'altra soluzione di piperidina DMF al 20% e reagire per 10 minuti, intervallando un lavaggio con DMF. Una volta completata la reazione, scolare e lavare tre volte con DMF.
Passaggio 2:Sciogliere 5,09 g di Fmoc-Val-OH, 2,02 g di HOBT (1-idrossibenzotriazolo) e 2,32 ml di DIC (N,N'-diisopropilcarbodiimmide) in DMF a 0°C. Dopo completa dissoluzione, aggiungere la miscela alla colonna di reazione e far reagire a temperatura ambiente per 1 ora. Monitorare l'andamento della reazione utilizzando il test della ninidrina, assicurandosi un risultato negativo. Al termine della reazione, lavare tre volte con DMF per ottenere la resina Fmoc-Val-ammino.
II. Preparazione del peptide di resina completamente protetto di Melanotan I.
Passaggio 1:Aggiungere il 20% di piperidina in soluzione DMF (rapporto in volume) alla suddetta Fmoc-Val-aminoresina. Reagire per 5 minuti, quindi aggiungere un'altra porzione di piperidina al 20% in soluzione DMF e reagire per 10 minuti. Lavare una volta con DMF durante l'intervallo. Una volta completata la reazione, asciugare sotto vuoto e lavare tre volte con DMF.
Passaggio 2:Sciogliere 5,06 g di Fmoc-Pro-OH, 2,02 g di HOBT (1-idrossibenzotriazolo) e 2,32 ml di DIC (N,N'-diisopropilcarbodiimmide) in DMF a 0°C. Dopo completa dissoluzione, aggiungere la miscela alla colonna di reazione e far reagire a temperatura ambiente per 1 ora. Monitorare l'andamento della reazione utilizzando il test della ninidrina (test Kaiser) fino all'ottenimento di risultati negativi. Al termine, lavare tre volte con DMF per ottenere Fmoc-Pro-Val-aminoresina.
Passaggio 3:Seguendo il metodo descritto nel passaggio 2, accoppiare in sequenza ciascun amminoacido secondo la sequenza di Melanotan I. Dopo il completamento della reazione di accoppiamento Ac-Ser(tBu)-OH, lavare tre volte con DMF, tre volte con DCM (diclorometano) e tre volte con metanolo. Essiccare sotto vuoto per ottenere 23,89 g di peptide legato alla resina Melanotan I completamente protetto.
III. Preparazione del peptide grezzo di Melanotan I
23,89 g di peptide legato alla resina Melanotan I completamente protetto sono stati posti in un pallone a fondo tondo. A 0°C, 250 ml di un cocktail di scissione pre-preparato (composto da TFA:tioanisolo:fenolo:triisopropilsilano:acqua = 82,5:7,5:5:3:2 in volume) sono stati aggiunti lentamente sotto agitazione. La miscela è stata fatta reagire a bassa temperatura per 0,5 ore, seguita da reazione a temperatura ambiente per 2 ore. La soluzione di scissione è stata quindi filtrata sotto vuoto. Questa soluzione è stata aggiunta lentamente a 2 L di etere etilico anidro ghiacciato sotto agitazione. Il peptide grezzo è stato isolato mediante filtrazione, lavato tre volte con etere etilico ghiacciato e sono stati ottenuti 8,55 g di peptide grezzo di Melanotan I.
IV. Preparazione del peptide purificato Melanotan I
Passaggio 1:Sciogliere il peptide grezzo di Melanotan I in 100 ml di acqua purificata e filtrare attraverso una membrana da 0,45 μm per ottenere una soluzione di peptide grezzo.
Passaggio 2:Purificare il peptide Melanotan I grezzo utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Utilizzare una colonna a compressione assiale dinamica DAC-HB50 con fase mobile A (soluzione acquosa di acido trifluoroacetico allo 0,05%) e fase mobile B (acido trifluoroacetico allo 0,05% in acetonitrile). Eseguire l'eluizione in gradiente per la separazione e la purificazione. Rilevare il campione utilizzando un rilevatore UV e raccogliere la soluzione peptidica corrispondente al picco target in frazioni.
Passaggio 3:Dopo purificazione HPLC ottenere 180 ml di soluzione di trifluoroacetato di Melanotan I con purezza superiore al 99%. Concentrare la soluzione a 50 ml mediante evaporazione rotante.
Passaggio 4:Equilibrare la colonna cromatografica con acqua deionizzata e caricare 50 ml della soluzione purificata di trifluoroacetato di Melanotan I (purezza> 99%). Eluire per 50 minuti in una soluzione acquosa di acido acetico al 2%. Concentrare il prodotto target raccolto a 80 ml tramite evaporazione rotante. Eseguire la pre-liofilizzazione e la liofilizzazione per ottenere infine 5,33 g di peptide purificato Melanotan I, con una resa del 32,33%.
Orario di pubblicazione: 2026-01-05